派真生物精心設計的專利型AAV Cas9表達載體，可在??單載體??中表達：??SpCas9、SaCas9??、??sgRNA??或者??Cas9和sgRNA。
可在派載體中設計
- SpCas9：雙載體或單載體
派真生物精心設計的專利型 SpCas9 表達載體，可在單個 AAV 載體中共表達 SpCas9 和 sgRNA。為了確保 SpCas9 表達序列不超過 AAV 載體容量（約 5Kb），派真生物使用緊湊高效的啟動子序列 EF1s 或 miniCMV。對于 sgRNA 表達，派真生物使用高效且相對較短的 H1 啟動子來縮短 sgRNA 表達框的總堿基長度。通過這種策略，派真構建了一個能夠高效地共表達 SpCas9 和 sgRNA 的單個 AAV CRISPR 載體，最大限度地降低了混合細胞表達表型的風險以及產生不一致或假陽性數據的可能性。
- SaCas9: 雙載體或單載體
SaCas9是Cas9的緊湊型變體，其基因長度僅約??3.2 kb??（SpCas9為4.2 kb），在保持與SpCas9相當的DNA切割活性同時，顯著適配AAV載體的容量限制。此外，SaCas9識別PAM序列為??NNGRRT??，在宿主基因組中出現頻率低（約每32 bp出現一次），大幅降低非靶標區域結合概率。SaCas9靶向DNA序列長度為??21-23 nt??（SpCas9通常為20 nt），特異性更強。PAM 頻率的降低和靶序列長度的延長使 SaCas9 具有更高的結合特異性，與傳統 SpCas9 相比，理論上脫靶率更低。
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- SpCas9HF
高保真SpCas9
- SaCas9HF
高保真SaCas9
- AAV-CRISPR 激活MS2-P65-HSF1
雖然Cas9通常與傳統的sgRNA配對以實現靶向基因敲除，但其也可與??經MS2 RNA連接支架修飾的sgRNA??結合，實現類似的功能。在此改造后的MS2系統中，SpCas9失去DNA切割活性（變為dCas9），轉而募集??MS2-P65-HSF1轉錄激活復合體??，驅動下游基因轉錄。該方法可實現??內源基因的轉錄激活??，表達水平可提升超過1000倍。
- NmCas9
長度為 3.3 kb 的 NmCas9 是 Cas9 的替代版本，其活性與 SpCas9 相似，但在需要極低脫靶率的應用中更具優勢。NmCas9 識別更長的 PAM 序列 (NNNNGATT)，其出現頻率低于 SpCas9 PAM，大約每 128 bp 出現一次。再加上其 21-23 nt 的延伸靶序列長度，使其具有更高的靶特異性。這些特性使得 NmCas9 的脫靶率理論上低于其他 Cas9 變體，使其成為高精度基因組編輯應用的理想選擇。
- AsCpf1 and LbCpf1
雖然 Cas9 及其變體是最常用的 CRISPR 效應內切酶，但 Cpf1 內切酶作為 CRISPR 基因編輯的替代方案也越來越受歡迎。與 Cas9 類似，Cpf1 需要 gRNA 激活，結合鄰近 PAM 序列的基因組 DNA，并在 sgRNA 靶序列退火后切割 DNA。然而，Cpf1 比 Cas9 短，因此需要更短的 sgRNA 才能發揮全部功能。另一個關鍵區別是，Cas9 產生平端 DNA 切口，而 Cpf1 產生 4-5 個堿基對突出的粘性末端，從而有助于低錯誤率且可控的基因插入。
什么是CRISPR?
CRISPR是一種??尖端基因編輯技術??，能夠實現對目標基因的??敲除??（Knockout）、??定點突變??（Mutate）或??過表達??（Overexpress）。基于CRISPR的研究策略因其??高效穩定??的編輯性能與??操作簡便??的作用機制，已在分子生物學、醫學及農業等領域廣泛應用
CRISPR 基因編輯需要三個組成部分：(1) 向導 RNA (gRNA)、(2) Cas9 內切酶和 (3) 目標基因組內的原型間隔區相鄰基序 (PAM)。gRNA 是一種單鏈 RNA 分子，由兩個區域組成：(1) 與目的基因的 15-24 個堿基對片段互補的基因靶向序列，以及 (2) 與 Cas9 結合的支架區。gRNA 支架區與 Cas9 內切酶結合，同時 gRNA 的宿主 DNA 補體區域不結合。然后，Cas9-gRNA 復合物可以掃描宿主細胞的基因組 DNA 以尋找稱為 PAM 的特定 2-6 個堿基對序列。一旦 Cas9-gRNA 復合物識別 PAM 序列，gRNA 的基因靶向區域就會與 PAM 序列相鄰的宿主 DNA 退火。在 gRNA 基因靶向區域成功結合后，Cas9 將切割與 PAM 序列相鄰的宿主 DNA。
Cas9介導的DNA切割通常會導致基因轉錄嚴重中斷，并在DNA修復后導致功能性基因敲除。或者，切割可用于引入精確的DNA突變，或使用修飾的gRNA支架區域來激活基因表達，該支架區域可抑制Cas9的切割能力，同時將轉錄蛋白募集到基因啟動子區域。重要的是，靶DNA識別的特異性使得設計針對幾乎任何基因的基于CRISPR的基因編輯策略成為可能。
基于 CRISPR 基因編輯的 AAV 載體設計和生產既具有挑戰性又耗時。派真生物專業的團隊擁有豐富的經驗和專業知識，能夠提供高質量的 CRISPR-AAV，省時又省力。
