一、研究背景
基因治療為許多遺傳性疾病患者帶來了希望，以 AAV9 為代表的重組腺相關病毒載體（rAAV）在脊髓性肌萎縮癥（SMA）、杜氏肌營養不良（DMD）等罕見病治療中屢創奇跡。然而，預存免疫仍然是AAV基因治療的主要障礙。30-80%的成年人體內存在針對常見AAV血清型(如AAV2、AAV9等)的中和抗體（NAbs）。初次給藥后，患者還會產生高滴度、持久的 NAbs，使重復給藥更加困難。若給免疫陽性患者注射 AAV，會因載體被中和及轉導組織出現 T 細胞浸潤而顯著降低療效，甚至誘發血栓性微血管病、非典型溶血尿毒綜合征等嚴重不良反應。
目前最常見的應對策略是排除血清陽性患者，但高陽性率大幅縮小了適應人群。研究顯示，45% 的 AAV 臨床試驗排除 NAbs 陽性受試者，血液病試驗中這一比例超過 90%。
另有研究采用利妥昔單抗清除 B 細胞或雷帕霉素抑制 T 細胞等免疫抑制方案，但這些藥物副作用明顯，且無法完全避免免疫介導的毒性。
如何打破這一僵局？科學家們將目光投向了進化的遠端。
近日，杜克大學 Aravind Asokan 團隊在國際著名期刊《Cell Reports Medicine》?上發表了題為?“Complete neutralizing antibody evasion by serodivergent non-mammalian AAVs enables gene therapy redosing”的文章。該研究利用非哺乳動物來源的 AAV（Non-mammalian AAVs），開發出了一種具有免疫逃逸能力、血清學上高度差異化的新型載體 AAV.div3A，并成功實現了基因治療的重復給藥。這一突破為那些因抗體陽性而無法治療，或急需二次治療的患者打開了新的希望之門。
二、主要研究方法和研究結果
1.構建多樣性的Dependoparvovirus衣殼文庫
這項研究的核心邏輯在于：靈長類來源的 AAV 同源性太高，抗體容易發生交叉反應。如果使用進化距離極遠的鳥類或爬行類病毒，人體的免疫系統是否就會“視而不見”？因此，研究團隊首先構建了一個由多種且分化顯著的非靈長類依賴性細小病毒（Dependoparvovirus）分離株組成的文庫（AAV.div library）。
研究者對435個Dependoparvovirus的VP1序列進行主成分分析和K-means聚類，從非靈長類分支中選擇16個候選衣殼，它們與靈長類AAV的VP1相似度最高僅60%，彼此間相似度不超過73%（圖1）。
先前研究發現，非哺乳動物 AAV 無法轉導人細胞，但把靈長類 AAV VP1 的 40 個氨基酸 N 端移植過去即可恢復轉導；AAV2 或 AAV8 N 端效果相近，而 AAV5 或海獅 AAV N 端則改變嵌合特性，使其能轉導 GPR108 缺失細胞。為捕獲更大序列多樣性和生物學差異，研究團隊采用矩陣策略，將?5種N端結構域(來自AAV2/AAV5/AAV8/海獅AAV/野生型)分別與?16?個候選衣殼組合，共構建80個嵌合衣殼。每個衣殼配套攜帶唯一的10核苷酸條形碼的自身互補型CBh-GFP-barcode ITR質粒。
圖1.?依賴性細小病毒（Dependoparvovirus）衣殼文庫的設計與篩選。(A) 依賴性細小病毒屬的最大似然系統發育樹。基于294株依賴性細小病毒的Rep78序列，使用IQ-TREE推斷其親緣關系。根據序列相似性將病毒株劃分為不同亞支。灰色框表示被選入衣殼矩陣的支系。(B) 代表性依賴性細小病毒的結構與基因組，突出顯示N端結構域。(C) 依賴性細小病毒VP1蛋白序列的主成分分析（n = 435）。采用K-means聚類。藍色為AAV2樣病毒株，灰色為雁形目依賴性細小病毒樣病毒株，綠色為其他依賴性細小病毒株。矩陣候選者以紅色標記。(D) 衣殼矩陣條形碼篩選示意圖。將16種AAV衣殼與5種VP1 N端序列的DNA序列進行組合克隆，共獲得80種衣殼序列。每種衣殼使用獨特的條形碼ITR質粒，在2個15 cm皿的HEK293細胞中進行三質粒共轉染。轉染后第3天和第7天收集培養基并合并，最終純化為單一病毒庫。向3只雌性C57BL/6J小鼠尾靜脈注射5×1013 vg/kg的混合AAV文庫；細胞實驗以1×10? vg/細胞的劑量進行三個重復感染。小鼠在14天后處死，細胞在感染后48小時收集。提取DNA和RNA后，擴增AAV基因組中的條形碼區域并進行NGS測序。通過分析條形碼，確定篩選前后每種衣殼的相對豐度。(E) 衣殼文庫火山圖。數據跨重復實驗和組織/細胞類型合并。倍數變化（fold change）定義為篩選后文庫中某衣殼占比與輸入文庫中占比的比值。(F) 倍數變化（FC）直方圖。數據跨重復實驗和組織/細胞類型合并。倍數變化定義為篩選后文庫中某衣殼占比與輸入文庫中占比的比值。
2.體內外高通量篩選后，AAV.div3A脫穎而出
NGS測序結果顯示，在不同組織和細胞中，表現最佳的衣殼來自番鴨（Muscovy duck）AAV。病毒生產定量結果顯示，番鴨AAV/AAV2 N端嵌合體(AAV.div3A)在產量和載體質量上與AAV9標準對照相當；結構建模顯示，番鴨來源的衣殼與靈長類來源的衣殼表面差異巨大，表面可變區（VR）發生了明顯攪動。這些表面擾動區域正是靈長類 AAV 介導受體結合與中和抗體識別的關鍵位點。
AAV.div3A 或 AAV9（均包裝 ss-CBh-Luc-P2A-GFP）小鼠體內研究結果顯示，心臟、骨骼肌和肝臟均檢測到強勁的熒光素酶表達，腦、腎、脾亦有信號。多數組織間 AAV.div3A 與 AAV9 轉導水平無統計學差異，僅心臟略低于 AAV9（圖2）。
圖2. 文庫篩選確定 AAV.div3A 為表現最佳的嵌合衣殼。(A) 衣殼富集分析。取每種衣殼在體內表現最佳的 N 端片段，計算其在肝臟、骨骼肌和心臟組織中的平均 RNA 富集倍數（FC）。以腓腸肌作為骨骼肌代表組織。若某衣殼在文庫輸入中的占比低于 0.015%，則剔除。(B) 衣殼排序。依據“體內表現最佳的 N 端片段”的 RNA 富集倍數，為每種衣殼確定相對排名。輸入占比 <0.015% 的衣殼被排除。生物學重復取均值作圖。(C) 病毒產量比較。對 AAV.div3A 與 AAV9 分別進行 4 次獨立制備：每次用 10–20 盤 15 cm HEK293 細胞，每盤共轉染 12 μg pXX680、10 μg pLH-RepCap 和 6 μg ITR 質粒。第 3 天和第 7 天收集體外培養液與細胞，經 PEG 沉淀、碘克沙醇超速離心及換液濃縮純化。以 qPCR 檢測 ITR 拷貝數定量，并將總產量按每盤細胞數歸一化。(D) 結構對比。將 AAV.div3A（紅色）與 AAV9（灰色）衣殼或三聚體疊加顯示，以突出表面結構差異。AAV.div3A 衣殼由 AlphaFold3 預測的 VP3 結構經 CapBuild 構建，并用 ChimeraX 可視化（pTM = 0.92）；AAV9 衣殼結構取自 PDB 7MT0。(E) 體內轉導實驗。雌性 C57BL/6J 小鼠經尾靜脈注射包裝 ss-CBh-Luc-P2A-GFP 的載體，劑量 5×1013 vg/kg。6 周后處死，通過熒光素酶活性測定轉導效率，仍以腓腸肌作為骨骼肌代表。虛線表示未轉導組織的背景發光值。
3.AAV.div3A的血清學特征：零交叉反應，零血清流行率
4.AAV.div3A 可逃避預先存在的中和抗體及載體誘導的免疫反應
為了評估 AAV.div3A 在體內的免疫逃避能力，研究團隊在小鼠體內進行了被動免疫和載體誘導的免疫實驗。
被動免疫實驗：先給小鼠腹腔注射“AAV9 中和抗體陽性人血清”，72 h 后再尾靜脈注射 5×1013 vg/kg 的 AAV9 或 AAV.div3A。不同組織的轉基因表達與分布結果顯示，AAV9 組心臟、肌肉、腦的熒光素酶信號被完全“中和”，跌至背景以下，相比之下，AAV.div3A 組各組織表達絲毫未降，全面碾壓 AAV9。
載體誘導的免疫實驗：先用 5×1012 vg/kg “空殼” AAV9 給小鼠“預免疫”6 周，再分別追加 AAV9 或 AAV.div3A（同劑量、包裝 ss-CBh-Luc-P2A-GFP）。結果顯示，二次給 AAV9，轉導效率完全喪失，轉基因水平比未免疫小鼠低 >99%。相比之下，二次給 AAV.div3A，所有組織依舊高表達，肝臟信號甚至反超對照。
5.理性改造 AAV.div3A 衣殼提升組織特異性
針對杜氏肌營養不良、龐貝病等肌肉疾病治療需求，研究團隊采用理性設計策略，在 AAV.div3A 的 VR8 區插入含 RGD 的肽段，旨在通過衣殼改造提升其肌肉特異性。體外細胞篩選顯示，攜帶 MyoAAV 4A 序列的 AAV.div3A-M4 表現最為搶眼，在成肌細胞中的轉導效率較親本提升了 20 倍（圖3）。
然而，體內實驗呈現了截然不同的結果。在小鼠尾靜脈注射后，細胞實驗中表現優異的 M4 突變體并未在體內顯著提升轉導效率；反而是采用本組前期序列的 AAV.div3A-M1 脫穎而出。M1 突變體在心臟和膈肌的轉基因表達分別提升了 14 倍和 12 倍，同時實現了顯著的肝臟“去靶向”效果，肝內基因組減少 95%，心臟/肝臟表達比值高達 13 倍，展現出卓越的肌向性。
進一步研究發現，這種增強效應具有嚴格的位點依賴性，M1 肽段僅在插入 VR8 區時有效。免疫學評估表明，雖然單純的肽段插入并未賦予載體額外的抗體逃逸能力，但也未引發異常的中和或交叉反應，證明了該改造策略的安全性與潛力。
圖3.?理性改造 AAV.div3A 衣殼獲得肌向變異體。(A) AlphaFold3 預測的 VR8 環結構。左側紅色為 AAV.div3A，灰色為 AAV.div3A-M1；右側灰色為 AAV.div3A-M4。(B) 體外轉導。以 5×10? vg/cell 的 MOI 感染C2C12 細胞，72 h 后行熒光素酶檢測。(C–F) 體內轉導。雌性 C57BL/6J 小鼠尾靜脈注射 5×1013 vg/kg 劑量，6 周后取膈肌 (C)、心臟 (D)、肝臟 (E) 及腓腸肌 (F) 行熒光素酶檢測；虛線為背景發光值。(G) 各組織中 AAV.div3A-M1 轉導值相對于 AAV.div3A 的比值。(H) AAV.div3A 與 AAV.div3A-M1 在各組織的轉導值分別以其自身肝臟值為基準進行歸一化。
6.AAV.div3A 在龐貝病小鼠模型中實現治療性二次給藥
為了驗證 AAV.div3A 在臨床治療中的實際潛力，研究團隊將目光投向了龐貝病——一種需長期管理的常染色體隱性遺傳病。由于臨床上首次 AAV 治療后常因載體稀釋或基因沉默導致療效衰減，開發能夠有效“二次給藥”的載體成為了攻克此類疾病的關鍵。
研究者在幼年龐貝病小鼠中模擬了這一臨床難題：在首劑 AAV9 治療四周后進行二次注射。結果顯示，重復給予 AAV9 的小鼠轉基因表達不升反降；而采用 AAV.div3A 或其肌肉靶向性變體 div3A-M1 作為第二劑給藥時，則顯著提升了小鼠體內的 GAA 酶水平（圖4）。
尤為值得關注的是 AAV.div3A-M1 的表現，它在重復給藥場景下再次驗證了卓越的肌肉靶向性優勢。與單次治療相比，它使膈肌和心臟的酶活性分別提升了 9 倍和 7 倍。這一結果有力證明，基于 AAV.div3A 的衣殼系統不僅能實現成功的治療性再給藥，更能通過精準的組織靶向，為此類遺傳病的終身治療提供了極具前景的新策略。
圖4.基于 AAV.div3A 衣殼的龐貝病模型重復給藥治療研究。(A) GAA 重復給藥實驗流程。B6:129 背景 GAA 敲除小鼠經尾靜脈注射 2×1012 vg/kg的 ssAAV9-CBh-GAA；4 周后，再次尾靜脈注射 2×1013 vg/kg的 AAV9、AAV.div3A 或 AAV.div3A-M1（均包裝 ss-CBh-GAA），或給予 PBS 對照（每衣殼組 3 雌 2 雄）。第 10 周處死，取組織以 4-MUG 熒光法測定 GAA 活性。(B–E) 重復給藥后的 GAA 活性。二次給藥 6 周后，分別檢測膈肌 (B)、心臟 (C)、肝臟 (D) 及腓腸肌 (E) 的 GAA 活性，數據以 nmol 底物·h?1·mg 蛋白?1 表示。
三、討論與總結
1.跨越物種界限
Dependoparvovirus 屬在自然界中擁有極高的遺傳多樣性，涵蓋禽類、爬行類等多種宿主，但因跨物種感染障礙，這一巨大寶庫長期未被基因治療領域開發。本通過一項簡單而高效的策略——僅替換極小的 N 端結構域，便成功打破了這一壁壘，讓源自番鴨的遠緣病毒能在人類細胞中高效運作。篩選出的候選株 AAV.div3A 不僅轉導強勁，更具備獨特的生物學特征：它不依賴傳統的 AAVR 受體進入細胞，這使其成為除 AAV4 外首個被證實擁有獨立入胞機制的天然分離株。
2.天然的“隱身衣”：逃逸中和抗體與免疫記憶
AAV.div3A 的最大優勢在于其獨特的免疫學特性。由于它源自與哺乳動物親緣關系較遠的番鴨，其衣殼蛋白（VP1）與靈長類 AAV 的相似度僅為 59%。這種巨大的進化差異賦予了它天然的“隱身”能力：它不僅在人群中無預存免疫，更能在擁有高滴度 AAV9 抗體的小鼠體內實現高效轉導，甚至表現出抗體依賴性的增強效應。這意味著，對于那些因體內存在中和抗體而被傳統基因療法拒之門外的患者，AAV.div3A 提供了一條全新的治療路徑。
3.規避 T 細胞攻擊，實現安全的二次給藥
除了體液免疫，細胞免疫也是阻礙 AAV 重復給藥的主要障礙。通常，初次給藥誘導的記憶 T 細胞會在二次給藥時被激活，導致轉基因表達喪失。然而，以 AAV.div3A 進行二次給藥時，并未出現這種“免疫排斥”現象。生物信息學分析提示，這是因為引入的 N 端片段極小，且缺乏主要的 T 細胞抗原表位，從而巧妙地避開了 HLA 分子的呈遞與識別，為治療的持久性提供了安全保障。
4.從“隱身”到“精準”：理性設計的肌肉特異性
在擁有免疫逃逸的底盤后，通過在衣殼表面理性插入 RGD 肽段，獲得了 AAV.div3A-M1 變體。該變體不僅繼承了親本的免疫逃逸能力，更獲得了卓越的肌肉特異性——極大地提升了心臟和膈肌的轉導，同時顯著降低了肝臟富集。這種“血清學獨立底盤 + 功能性肽段”的組合策略，在龐貝病模型中成功實現了治療性酶水平的再次提升，證明了其臨床應用價值。
四、前景與局限
- 新型衣殼篩選與驗證：我們建立了完善的 AAV 衣殼篩選平臺，可協助客戶評估包括非靈長類 AAV 在內的新型衣殼在不同組織中的轉導效率與靶向性。
- 免疫學分析服務：提供高靈敏度的中和抗體（NAb）檢測服務，以及針對預存免疫的血清學分析，助力臨床前研究的受試者篩選策略制定。
參考文獻
Loeb, E. J., Fergione, S. A., Yudistyra, V., et al. (2025). Complete neutralizing antibody evasion by serodivergent non-mammalian AAVs enables gene therapy redosing. Cell Reports Medicine, 6, 102475.?https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2025.102475
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