近年來(lái)，以腺相關(guān)病毒(AAV)為載體的基因治療捷報(bào)頻傳，多款突破性藥物成功獲批上市，為罕見(jiàn)遺傳病患者帶來(lái)了希望。然而面對(duì)心肌梗死這類常見(jiàn)疾病時(shí)，AAV卻顯得”力不從心”。癥結(jié)在于：現(xiàn)有的AAV就像”只有油門沒(méi)有剎車”的汽車——基因一旦表達(dá)，就無(wú)法控制它在何時(shí)開(kāi)啟、在哪里發(fā)揮作用、以及表達(dá)到什么程度。這種”失控”的風(fēng)險(xiǎn)，成為阻礙AAV基因治療從罕見(jiàn)病走向常見(jiàn)病、從粗放治療邁向精準(zhǔn)醫(yī)療的最大技術(shù)瓶頸。

心肌梗死等缺血性心臟病是全球頭號(hào)”殺手”。心肌梗死后心肌細(xì)胞大量丟失，殘存的心肌難以代償，最終導(dǎo)致心功能衰竭。科學(xué)家其實(shí)早已找到能讓心肌細(xì)胞重新增殖的關(guān)鍵基因，但這些”種子”用少了不起效，用多了會(huì)致命。以明星再生因子YAP5SA為例，它確實(shí)能強(qiáng)力啟動(dòng)心肌細(xì)胞分裂，讓受損的心臟長(zhǎng)出新細(xì)胞，但如果讓它持續(xù)表達(dá)，心肌細(xì)胞就會(huì)瘋狂增殖，心臟越長(zhǎng)越厚，最終導(dǎo)致心源性猝死。這就像給心臟踩了油門卻沒(méi)有剎車，結(jié)果”好心辦了壞事”。這種”要么無(wú)效、要么致命”的困境，讓無(wú)數(shù)心臟再生療法止步實(shí)驗(yàn)室。破局的關(guān)鍵在于：能否給基因裝上精準(zhǔn)”開(kāi)關(guān)”，讓它們完成任務(wù)后及時(shí)”退場(chǎng)”？

2025年6月，北京大學(xué)血管穩(wěn)態(tài)與重構(gòu)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郭宇軒/董爾丹研究員團(tuán)隊(duì)在Nature Cardiovascular Research雜志上發(fā)表了題為”The drug-elicitable alternative splicing module for tunable vector expression in the heart“的研究論文，為這一難題提供了突破性解決方案。該研究基于FDA已批準(zhǔn)的藥物，開(kāi)發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因開(kāi)關(guān)技術(shù)DreAM (Drug-elicitable alternative splicing module)，在小鼠心梗模型中實(shí)現(xiàn)了對(duì)心肌再生時(shí)間、強(qiáng)度和位置的精準(zhǔn)控制，成功避免了持續(xù)表達(dá)導(dǎo)致的猝死和肝癌風(fēng)險(xiǎn)。

研究亮點(diǎn)

• 拓展AAV基因治療應(yīng)用前景：DreAM技術(shù)實(shí)現(xiàn)了原有技術(shù)難以企及的對(duì)AAV基因表達(dá)在時(shí)間、空間和表達(dá)水平上的精細(xì)調(diào)控，有潛力改變AAV在基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究中的現(xiàn)有應(yīng)用模式，為全新形態(tài)的基因治療策略開(kāi)辟道路。

主要研究結(jié)果

1. DreAM技術(shù)的開(kāi)發(fā)

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)AAV基因表達(dá)的時(shí)空精準(zhǔn)調(diào)控，研究團(tuán)隊(duì)選擇了FDA批準(zhǔn)的小分子藥物Risdiplam作為”開(kāi)關(guān)”分子。Risdiplam最初獲批用于脊髓性肌萎縮癥治療，其作用原理是誘導(dǎo)含有特定核酸序列的RNA片段（假外顯子，PSE）發(fā)生選擇性剪接，從內(nèi)含子變成外顯子（圖1）。

圖1.?DreAM技術(shù)原理圖。 DreAM為一段含有[外顯子1-內(nèi)含子-假外顯子-內(nèi)含子-外顯子2]的核酸序列，其中假外顯子受Risdiplam調(diào)控且包含唯一的蛋白翻譯起始位點(diǎn)ATG。無(wú)藥物時(shí)：細(xì)胞將假外顯子當(dāng)作”垃圾”剪掉，mRNA中沒(méi)有ATG，基因無(wú)法表達(dá)（開(kāi)關(guān)關(guān)閉）。加入Risdiplam后：細(xì)胞將假外顯子保留下來(lái)，mRNA獲得ATG，基因開(kāi)始表達(dá)（開(kāi)關(guān)開(kāi)啟）。

研究團(tuán)隊(duì)首先用Risdiplam處理小鼠48小時(shí)后取心臟進(jìn)行RNA-Seq差異剪接分析，篩選出7個(gè)可被Risdiplam誘導(dǎo)RNA剪接變化的候選元件。隨后對(duì)這些候選基因進(jìn)行工程化改造：（1）保留RNA剪接過(guò)程中的三個(gè)關(guān)鍵剪接位點(diǎn)——5’剪接位點(diǎn)(5’SS)、3’剪接位點(diǎn)(3’SS)以及位于3’SS上游18-40 nt的分支位點(diǎn)(Branch points, BP)，刪除其余部分；（2）刪除所有外顯子中的起始密碼子(ATG)，僅保留Risdiplam激活的假外顯子序列中的一個(gè)ATG。基于此設(shè)計(jì)的調(diào)控元件能通過(guò)響應(yīng)Risdiplam保留包含ATG的假外顯子，從而控制蛋白質(zhì)的翻譯起始（圖2）。

通過(guò)構(gòu)建GFP報(bào)告基因質(zhì)粒在細(xì)胞中進(jìn)行篩選，研究團(tuán)隊(duì)最終獲得了來(lái)自Zfr基因、基因調(diào)控倍數(shù)最高的元件，命名為DreAM（Drug-elicitable Alternative-splicing Module，即藥物誘發(fā)的可變剪接模塊）。這種基于內(nèi)源性RNA剪接機(jī)制的”無(wú)蛋白”設(shè)計(jì)避免了傳統(tǒng)化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)的免疫原性問(wèn)題，且體積小巧（僅1.2 kb），不含外源轉(zhuǎn)錄因子，為臨床轉(zhuǎn)化鋪平了道路。

圖2.?DreAM技術(shù)的開(kāi)發(fā)

2. AAV-DreAM載體的體內(nèi)精準(zhǔn)調(diào)控能力驗(yàn)證

為了評(píng)估DreAM是否能在體內(nèi)對(duì)AAV基因進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，研究團(tuán)隊(duì)包裝了AAV-CMV-DreAM-GFP載體，通過(guò)皮下注射至出生后1天（P1）的小鼠體中，從動(dòng)力學(xué)和量效關(guān)系兩方面系統(tǒng)評(píng)估了DreAM系統(tǒng)在體內(nèi)調(diào)控AAV基因表達(dá)的特征。

結(jié)果顯示，在動(dòng)力學(xué)方面，單次給藥Risdiplam后，DreAM可在1天內(nèi)誘導(dǎo)心臟、肝臟和骨骼肌中基因表達(dá)達(dá)到峰值（心臟中超500倍，骨骼肌中超2500倍），并在3-5天內(nèi)迅速回落至基線水平，時(shí)間分辨率達(dá)2-3天（圖3）。

在量效關(guān)系方面，AAV-DreAM基因表達(dá)與Risdiplam的劑量呈正相關(guān)，且在心臟和骨骼肌中具有良好的基因表達(dá)量調(diào)控幅度。

為了驗(yàn)證DreAM在成體動(dòng)物中能否長(zhǎng)期反復(fù)調(diào)控基因表達(dá)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了心臟特異性的AAV-Tnnt2-DreAM-Luciferase載體并注射到成年小鼠體內(nèi)。隨后在0.5個(gè)月、1.5個(gè)月、3.5個(gè)月三個(gè)時(shí)間點(diǎn)反復(fù)給藥并進(jìn)行活體成像。結(jié)果顯示，每次給予Risdiplam都能成功”點(diǎn)亮”心臟的熒光素酶信號(hào)，證明DreAM開(kāi)關(guān)可在體內(nèi)反復(fù)開(kāi)啟，為慢性疾病的長(zhǎng)期管理提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

圖3.?DreAM作為Risdiplam的響應(yīng)性開(kāi)關(guān)，實(shí)現(xiàn)AAV基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)可逆調(diào)控

然而，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)AAV9-Tnnt2-DreAM存在”脫靶”問(wèn)題——基因不僅在心臟表達(dá)，也在肝臟泄漏表達(dá)，這是因?yàn)锳AV9病毒和Risdiplam藥物在肝臟的富集都超過(guò)了心臟。為此，團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了兩套”糾偏”方案：方案一，在基因序列中植入肝臟特異性miR-122靶點(diǎn)（miR122TS），讓肝臟自身的miRNA把泄漏的mRNA”清理”掉；方案二，更換病毒”外殼”——使用對(duì)心臟親和力更高的MyoAAV衣殼替代AAV9。結(jié)果顯示，兩種方法都成功將基因表達(dá)“鎖定“在心臟，大幅減少了肝臟泄漏（圖4）。

圖4.?消除DreAM元件的肝臟泄漏

3. AAV-DreAM調(diào)控YAP5SA表達(dá)實(shí)現(xiàn)可控的心肌細(xì)胞增殖

研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了AAV-Tnnt2-DreAM-YAP^5SA載體，在新生期小鼠中驗(yàn)證DreAM能否有效調(diào)控YAP^5SA的表達(dá)時(shí)間，以避免其長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)引發(fā)的不良事件（如心源性猝死）。在出生后1天(P1)遞送AAV后，第7天開(kāi)始連續(xù)4天給予Risdiplam（灌胃給藥，每天一次）。結(jié)果顯示，DreAM元件能有效響應(yīng)Risdiplam，調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)YAP^5SA的表達(dá)。在無(wú)Risdiplam激活的情況下，DreAM元件可有效防止因YAP^5SA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的小鼠死亡，這與常規(guī)AAV-YAP^5SA在5-11天內(nèi)引起100%動(dòng)物死亡形成鮮明對(duì)比（圖5）。

而在Risdiplam激活DreAM元件時(shí)，心臟YAP^5SA表達(dá)增強(qiáng)，小鼠表現(xiàn)為心臟收縮功能改善、心室壁增厚、心室腔縮小，心肌細(xì)胞橫截面積減小，表達(dá)增殖標(biāo)志物Ki67的心肌細(xì)胞數(shù)量顯著增多。這些結(jié)果表明，DreAM元件能有效調(diào)控YAP^5SA在小鼠心臟組織中的表達(dá)時(shí)長(zhǎng)及其介導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖程度，為安全的心臟再生治療奠定了基礎(chǔ)。

圖5.?DreAM可調(diào)控YAP5SA表達(dá)，避免心肌過(guò)度增生導(dǎo)致的小鼠死亡

4. AAV-DreAM-YAP5SA載體治療小鼠心肌梗死的有效性與安全性

研究團(tuán)隊(duì)在成年小鼠心肌梗死模型中系統(tǒng)評(píng)估了DreAM技術(shù)的治療潛力。首先，向心梗后3天的小鼠體內(nèi)遞送常規(guī)AAV-YAP^5SA載體（陽(yáng)性對(duì)照組），結(jié)果顯示該載體能部分恢復(fù)小鼠心臟收縮功能，使心室壁增厚，但在心肌梗死17-20天時(shí)小鼠全部死亡，再次證實(shí)了YAP^5SA長(zhǎng)時(shí)程過(guò)表達(dá)的嚴(yán)重副作用。

接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)向心梗后3天的小鼠遞送包含DreAM元件的AAV-YAP^5SA載體，在心梗后第8-9天連續(xù)兩天給予Risdiplam，控制YAP5SA僅表達(dá)3-4天。在此條件下，DreAM調(diào)控的YAP^5SA短暫表達(dá)使小鼠心功能明顯恢復(fù)，心臟纖維化面積減少，并且能有效避免小鼠死亡(圖6）。EdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示增殖細(xì)胞主要聚集在梗死邊界區(qū)，與AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域高度吻合，證明DreAM實(shí)現(xiàn)了空間上的精準(zhǔn)調(diào)控。這些結(jié)果充分證實(shí)了AAV-DreAM-YAP5SA載體對(duì)小鼠心梗表型具有顯著的緩解能力，并且該治療策略不會(huì)造成心肌細(xì)胞過(guò)度增殖和動(dòng)物死亡。

然而，AAV9和YAP可能導(dǎo)致肝損傷和肝臟腫瘤的發(fā)生，AAV9-DreAM-YAP^5SA載體的肝臟泄漏表達(dá)存在長(zhǎng)期安全性隱患。為了解決這一關(guān)鍵問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)將DreAM整合至心肌細(xì)胞特異性、肝臟去靶向的AAV9-Tnnt2-miR122TS載體中，對(duì)Risdiplam激活YAP^5SA表達(dá)4個(gè)月后的小鼠肝臟進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，遞送常規(guī)AAV9-DreAM-YAP^5SA的小鼠（6/6）出現(xiàn)明顯的腫瘤病變，肝臟腫瘤生物標(biāo)志物升高，而引入miR122TS后有效消除了肝臟腫瘤的發(fā)生（0/6），也降低了肝臟腫瘤生物標(biāo)志物的表達(dá)。重要的是，miR122TS不影響AAV9-DreAM-YAP^5SA對(duì)心肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，實(shí)現(xiàn)了“心臟獲益、肝臟安全”的精準(zhǔn)治療。

圖6.?DreAM實(shí)現(xiàn)YAP的瞬時(shí)激活，在改善心肌梗死相關(guān)心功能障礙的同時(shí)，避免了肝臟脫靶致瘤

研究意義

本研究利用FDA批準(zhǔn)的RNA剪接調(diào)控藥物Risdiplam，開(kāi)發(fā)了新型基因開(kāi)關(guān)DreAM，實(shí)現(xiàn)了AAV基因表達(dá)在時(shí)間、劑量和組織特異性上的精準(zhǔn)調(diào)控。該技術(shù)為AAV基因治療提供了全新的調(diào)控策略，并首次證明藥物誘導(dǎo)型開(kāi)關(guān)能夠同時(shí)提升AAV療法的有效性和安全性。

DreAM作為模塊化平臺(tái)，可與組織特異性啟動(dòng)子、miRNA靶序列、組織靶向性衣殼等元件靈活組合，構(gòu)建多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。更重要的是，其響應(yīng)藥物Risdiplam已獲FDA批準(zhǔn)且臨床安全性明確，這為DreAM的臨床轉(zhuǎn)化掃清了關(guān)鍵障礙。

DreAM有望重塑AAV基因治療的應(yīng)用范式。從心臟再生到基因補(bǔ)充療法、腫瘤治療和代謝病，它提供了一個(gè)通用工具——在恰當(dāng)時(shí)機(jī)、靶向組織、以適宜劑量表達(dá)治療基因，實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)方法無(wú)法企及的精準(zhǔn)治療。

研究團(tuán)隊(duì)介紹

本研究由北京大學(xué)血管穩(wěn)態(tài)與重構(gòu)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室PI郭宇軒研究員和董爾丹研究員為共同通訊作者。北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士研究生陳展、楊璐梓為共同第一作者。該研究獲得了北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院趙東宇教授、張巖教授、鄭樂(lè)民教授、周菁教授和北京大學(xué)藥學(xué)院的苗蕾教授、陳衛(wèi)老師的大力支持。波士頓兒童醫(yī)院William T. Pu教授、貝勒醫(yī)學(xué)院James F. Martin教授和孟凡森博士、首都醫(yī)科大學(xué)附屬安貞醫(yī)院高霏教授、四川大學(xué)華西第二醫(yī)院李一飛教授為本研究提供了重要幫助。該研究獲得”四大慢病”重大專項(xiàng)、北京市自然科學(xué)基金”非共識(shí)”創(chuàng)新項(xiàng)目和北京基馭醫(yī)療科技有限公司的大力資助。

參考資料來(lái)源

1. Chen Z, Yang L, Zhang Y, et al. The drug-elicitable alternative splicing module for tunable vector expression in the heart.?Nature Cardiovascular Research, 2025. DOI: 10.1038/s44161-025-00665-7

2.?https://mp.weixin.qq.com/s/1UK_9Bjyr7Y_yzHhy6tHpg